細胞骨架的熒光探針標記方法

細胞骨架主要有微管(micmtuble, MT)，微絲(microfilament, MF)，中間絲(intermediate filament, IF三種類(lèi)型。它們分別由不同的蛋白單體組裝而成，其中微管蛋白(tubulin)、肌動(dòng)蛋白(actin)、波形蛋白(vimentin)等是細胞骨架的重要組成部分，也是zui常被研究的細胞骨架蛋白。

1963年.Slauterback采用戊二醛常溫固定方法.首先使用電鏡在水螅刺細胞中發(fā)現了微管。隨后，微絲和中間絲相繼被發(fā)現。它們廣泛存在于真核細胞中.細胞骨架蛋白的含量占細胞總蛋白含量的10％-30％。它們與細胞形態(tài)的維持，細胞器的空間定位及位置改變.細胞的運動(dòng)。細胞內的物質(zhì)運輸，細胞內的信號傳導，免疫行為和細胞分裂等活動(dòng)有密切的關(guān)系。

一、細胞骨架的熒光探針標記方法

1. 微管蛋白(tubuline)的標記

一般使用間接標記的方法，一抗為抗tubulin單抗，二抗為抗小鼠IgG的熒光抗體，就可以展現出固定細胞，冰凍切片的微管結構。這種小鼠來(lái)源的單抗識別微管N端結構域的第69-97個(gè)氨基酸殘基。同時(shí)也是用于ELISA和Western blotting的抗體。檢測微管的其他探針有：Bis-ANS是離體狀態(tài)下微管裝配的強抑制劑，熒光探針與蛋白的疏水裂隙結合，且結合后熒光強度增強。用于檢測微管蛋白時(shí)間和溫度依賴(lài)性的解聚。DCVJ(4-(dicyanovinyl) julolidine) 用于活細胞微管蛋白裝配動(dòng)態(tài)過(guò)程的探針。它的作用可被細胞松弛素D(cytochalasin D) 所阻斷。

2. 微絲的標記

用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)標記。鬼筆環(huán)肽是從一種菌類(lèi)Amanita Dhalloides所提取出來(lái)的環(huán)肽。它與F—actin競爭性的結合。熒光標記的鬼筆環(huán)肽在納克水平就可與F-actin選擇性的結合并且易溶于水.為檢測組織切片.培養細胞和無(wú)細胞體系中的actin的定位和定量提供了非常方便的標記方法。在肌細胞和其他細胞中鬼筆環(huán)肽與actin亞單位一比一結合。并且不與G-actin結合。鬼筆環(huán)肽比actin的抗體標記有*性。首先，在不同種類(lèi)生物中它的結合性質(zhì)不發(fā)生改變。其次.鬼筆環(huán)肽標記的非特異性信號可忽略.因而圖像的反差較好。

3. 其他細胞骨架蛋白的標記

抗波形蛋白(vimentin)抗體?？鼓z質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）抗體，抗結蛋白抗體(Anti-Desmin Antibody)等。

二、細胞骨架的共聚焦研究技術(shù)

1. 激光共聚焦顯微鏡的工作原理

激光共聚焦顯微鏡選用單色性好，單向性好的激光作為光源。激光通過(guò)一個(gè)照明針孔到達樣品，樣品只被一個(gè)具有精密幾何形狀的光點(diǎn)照射在焦平面上，只有被照射到的特定點(diǎn)所發(fā)射的熒光通過(guò)探測針孔到達檢測器.該點(diǎn)以外的任何發(fā)射熒光均被該針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點(diǎn)或被探測點(diǎn)來(lái)說(shuō)是共軛的.這就是激光掃描共焦顯微鏡系統中共焦的真正含義。激光共聚焦顯微鏡利用光電倍增管采集和放大信號。計算機以像點(diǎn)的方式將成像點(diǎn)顯示在屏幕上，由光路中的掃描系統在整個(gè)樣品上掃描.在顯示器上產(chǎn)生一幅完整圖像。這幅圖像即為焦平面的共焦圖像。只要載物臺沿著(zhù)Z軸上下移動(dòng).將樣品新的一個(gè)層面移到共焦面上.樣品的這個(gè)新層面又成像在顯示器上。隨著(zhù)Z軸的不斷移動(dòng).就可得到樣品不同層面連續的光切圖像。我們將從共聚焦顯微鏡系統獲得的連續光切圖像比喻為顯微CT，從這些連續的光切圖像可通過(guò)三維重組模擬出樣品真實(shí)的立體結構。共聚焦顯微鏡憑借其*的成像原理大大提高了分辨率，它在X-Y平面的橫向分辨率比普通的顯微鏡要高出約40％，而且它還可以對厚樣本進(jìn)行非介入無(wú)損傷性連續光學(xué)切片，得到三維重組的空間立體圖像。近十年來(lái)，人們已廣泛應用CLSM來(lái)觀(guān)察和分析細胞內的微細結構和分子在細胞內的分布，觀(guān)察細胞內離子，蛋白分子的變化，包括細胞內鈣，活性氧，轉錄因子，表面分子，細胞凋亡，細胞膜流動(dòng)性，細胞內分子的運動(dòng).細胞間的縫隙連接，蛋白間的相互作用等。共聚焦的分析研究已經(jīng)涉及了生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域。

2. 激光共聚焦的圖像采集和圖像處理與數據分析方法

將制備好的細胞放在熒光顯微鏡的載物臺上進(jìn)行觀(guān)察找到需采集的視野，將熒光顯微鏡轉到掃描的位置。根據樣品的實(shí)際情況.在控制軟件的界面中選擇圖像采集的參數，包括激發(fā)光的波長(cháng)，發(fā)射光的范圍，掃描模式，掃描速度，探測針孔，電子放大倍數等參數。啟動(dòng)預掃，并調節光電倍增管的電壓PMT，Z軸的位置等，調節屏幕的圖像的細節清晰銳利，然后采集圖像。還可設定z軸的一定范圍。按照設定的步距進(jìn)行光學(xué)切片。采集得到的圖像還可以通過(guò)圖像處理和數據分析得到所需要的數據和圖像。三維光切的圖像可以顯示為假三維的疊加圖.還可以用軟件實(shí)現三維重組得到細胞和組織的空間圖像。

3．卵細胞紡錘體的激光共焦研究技術(shù)

以下就以家兔卵細胞的紡錘體的共焦研究為例來(lái)說(shuō)明細胞骨架共焦研究技術(shù)和方法。

1）MII期卵母細胞紡錘體的熒光染色：卵母細胞經(jīng)以下步驟處理

a. 固定及透化液(2％甲醛+0.1％Triton X-100+1μg／ml taxol)，30min。

b. PBS 3次，每次15min。

c. 封閉劑(PBS+2％BSA+2％正常羊血清+2％脫脂奶+0.01％Triton X-100+0.02％疊氮鈉+0.1mol/L甘氨酸)4℃隔一晚。

d. 鼠微管蛋白單克隆抗體(mouse monoclonal anti-a-tubulin)孵育30—60min。

e. 封閉液沖洗3次，15-20min／次。

f.  FITC標記的羊抗鼠IgG孵育30min， PBS洗3次。

g. 加入PI(碘化丙啶)0.5μg/ml, 10min，PBS洗2次。

所有步驟均在37℃下進(jìn)行。標本使用LEICA LCSSP2 Laser Scanning Confocal Microscope LCS軟件采集和處理圖像。

2) 圖像采集的儀器條件

物鏡采用HCX PL APO CS 63／1.32 OIL UV。雙通道采集信號，*通道激發(fā)波長(cháng)為488nm，發(fā)射波長(cháng)為515-535nm。第二通道激發(fā)波長(cháng)為543nm，發(fā)射波長(cháng)為590-630nm。采集模式為xyz，Pinhole為1.60，z軸的總厚度為10.36mm，Z軸以1.4mm為步距連續光切。

三、激光共焦顯微鏡在細胞骨架研究中的優(yōu)勢

1. 分辨率高.激光共焦顯微鏡比傳統顯微鏡的分辨率高1.4倍。對于觀(guān)察細胞骨架等微細結構比傳統熒光顯微鏡*。共焦顯微鏡只采集到樣品焦平面的像.使細胞骨架的像更加清晰。

2. 激光共焦顯微鏡實(shí)現了對樣品的不同層面進(jìn)行掃描從而產(chǎn)生不同層面的共焦圖像。細胞骨架和細胞骨架所形成的一些結構。如紡錘體都具有一定的空間分布.利用激光共焦顯微鏡可以對這些結構進(jìn)行無(wú)損傷的連續三維光切，形成他們的疊加圖像.或經(jīng)過(guò)共焦的圖像處理，三維重組得到他們的立體圖像。這一點(diǎn)是其他的檢測方法所無(wú)法做到的。

3. 與電鏡相比，標本制備要簡(jiǎn)便的多，既省時(shí)又省力。還可以避免標本制備過(guò)程中的假陽(yáng)性。

綜上所述.激光共焦顯微鏡因為其*的成像原理決定了它在細胞骨架研究中的重要地位。這項技術(shù)的發(fā)展為人類(lèi)更好的認識和研究細胞骨架的功能及其與疾病的關(guān)系提供了很好的研究手段。