哪些因素影響了高保真DNA聚合酶的保真度？
更新時(shí)間：2020-10-22 點(diǎn)擊次數：1730
高保真DNA聚合酶的保真度是指準確復制目的模板的結果。具體來(lái)說(shuō)，這涉及到多個(gè)步驟，包括讀取模板鏈，選擇正確的三磷酸核苷，并將此核苷酸插入3’引物末端的能力。為了區分正確和錯誤的核苷酸，一些DNA聚合酶具有3’到5’核酸外切酶活性。這種“校正”活性可切除不正確摻入的單核苷酸，并將其替換成正確的核苷酸。高保真PCR使用摻入錯誤率低且具有校正活性的DNA聚合酶，以保證目的DNA的忠實(shí)復制。
在設計PCR實(shí)驗時(shí)，你首先要考慮你的應用是否需要高保真聚合酶。如果實(shí)驗結果依賴(lài)于正確的DNA序列（如克隆或測序），那么你就要盡量減少錯配核苷酸的摻入。而對于普通PCR或菌落PCR，確定擴增子是否存在或質(zhì)粒上是否帶有插入片段，那高保真則大可不必。由于某些高保真聚合酶的強勁特性，一些研究人員在所有擴增中都使用它們。
關(guān)于DNA聚合酶的高保真，目前還沒(méi)有統一的定義。人們往往與TaqDNA聚合酶比較，來(lái)判斷保真度的相對高低。例如，NEB（NewEnglandBiolabs）的科學(xué)家測定Taq聚合酶的錯誤率為2.7x10-4±0.8x10-4，或每3700個(gè)堿基1個(gè)錯誤。這些數據表明，利用Taq以25個(gè)PCR循環(huán)擴增400bp的片段，可能一半的克隆都帶有錯誤。對于較大的片段如1kb，每個(gè)克隆都可能帶有不想要的突變。相比之下，NEB的Q5超保真聚合酶的錯誤率比Taq低100倍。根據這一數據，200個(gè)克隆中的199個(gè)將是正確的。
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