慢病毒系列，基因調控“多面手”（內含活動(dòng)）

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慢病毒常被用作基因傳遞和基因編輯工具，在基因治療、基因表達調控、疾病模型構建等領(lǐng)域有著(zhù)廣泛的應用

主要特點(diǎn)

1. 穩定的基因傳遞和表達: 慢病毒載體能夠將外源基因穩定地整合到宿主細胞基因組中，并且在細胞分裂過(guò)程中傳遞給后代細胞。這種整合性基因傳遞方式確保了外源基因在宿主細胞中的長(cháng)期穩定表達。

2. 可控的基因表達水平: 通過(guò)調整慢病毒載體的構建和設計，可以實(shí)現對外源基因表達水平的調控。例如，可以利用不同的啟動(dòng)子、增強子和調節元件來(lái)控制基因的轉錄水平，從而實(shí)現對目標基因的表達量調節。

3. 多功能性應用: 慢病毒載體不僅可以用于基因傳遞和基因表達調控，還可以用于基因編輯、基因治療、細胞工程等多種應用，如CRISPR/Cas9介導的基因編輯、CAR-T細胞治療等。通過(guò)慢病毒載體的介導，可以將基因編輯工具或特定基因序列導入目標細胞中，實(shí)現對基因的精準編輯和調控，從而改變細胞的功能和特性，實(shí)現基因修復、突變或敲除等功能。

讓我們來(lái)看看如何利用慢病毒載體多面操縱基因調控

一、慢病毒載體介導編碼基因過(guò)表達及點(diǎn)突變

★文章標題：Gain-of-function mutations in the catalytic domain of DOT1L promote lung cancer malignant phenotypes via the MAPK/ERK signaling pathway

★發(fā)表期刊：Science Advances

★作者單位：沈陽(yáng)藥科大學(xué)

本文中，作者鑒定了組蛋白甲基轉移酶DOT1L中的一系列功能獲得性突變。其中強的是位于催化DOT結構域R231Q，R231Q可以增強DOT1L的底物結合能力。此外，R231Q 在體外和體內促進(jìn)肺癌細胞的細胞生長(cháng)和耐藥性。機制研究還表明，R231Q突變體通過(guò)富集RAF1啟動(dòng)子上的H3K79me2和表觀(guān)遺傳調控下游靶標的表達來(lái)特異性激活MAPK/ERK信號通路。DOT1L抑制劑（SGC0946）和MAPK/ERK軸抑制劑（binimetinib）的聯(lián)合運用可以有效逆轉R231Q誘導的表型。以上研究結果揭示了表觀(guān)遺傳酶的功能獲得性突變，并為肺癌患者的精準治療提供了有希望的見(jiàn)解。

圖1. 組蛋白甲基轉移酶DOT1L的R231Q位點(diǎn)突變可以增強DOT1L的底物結合能力，促進(jìn)腫瘤生長(cháng)

二、慢病毒載體介導非編碼基因circRNA過(guò)表達

★文章標題：CircCRIM1 suppresses osteosarcoma progression via sponging miR146a-5p and targeting NUMB

★發(fā)表期刊：American Journal Of Cancer Research

★作者單位：江蘇大學(xué)醫學(xué)院

CircCRIM1是一種環(huán)狀RNA，通過(guò)反向剪接基因CRIM1形成。最近的研究表明，CircCRIM1在包括骨肉瘤（OS）在內的多種惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生中具有多種功能。本文作者研究了circCRIM1在OS進(jìn)展中的作用和機制。通過(guò)檢索GSE96964的circRNA表達微陣列數據集，篩選OS和人成骨細胞（hFOB1.19）中差異表達的circRNA（包括circCRIM1）。RT-qPCR檢測circCRIM1及其海綿miRNA和靶基因的表達水平。通過(guò)體外功能獲得實(shí)驗研究了circCRIM1對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過(guò)測量裸鼠皮下和原位腫瘤生長(cháng)來(lái)評估 circCRIM1對OS的體內功能。circCRIM1的過(guò)表達抑制了OS細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內OS腫瘤的生長(cháng)。在機制上，作者通過(guò)生物信息學(xué)預測將miR146a-5p鑒定為circCRIM1的海綿miRNA，并通過(guò)報告基因檢測和FISH分析證實(shí)了它們的相互作用和共定位。這種相互作用導致下游靶基因NUMB的表達增加，這將導致Notch信號通路的抑制。作者進(jìn)一步證明了miR146a-5p過(guò)表達可以逆轉OS細胞中circCRIM1誘導的抗腫瘤作用。以上研究結果支持circCRIM1通過(guò)海綿化miR146a-5p及其下游靶標NUMB在OS中充當腫瘤抑制因子。

圖2. circCRIM1的過(guò)表達抑制了骨肉瘤細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內骨肉瘤瘤的生長(cháng)

三、慢病毒載體介導非編碼基因LncRNA干擾

★文章標題：Long noncoding RNA AGPG regulates PFKFB3-mediated tumor glycolytic reprogramming

★發(fā)表期刊：Nature communications

★作者單位：中山大學(xué)

腫瘤細胞通常會(huì )重新編程其新陳代謝以實(shí)現快速增殖。長(cháng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在代謝重塑中的作用及其潛在機制仍然難以捉摸。通過(guò)篩選，作者發(fā)現lncRNA AGPG是食管鱗狀細胞癌（ESCC）中糖酵解活性增加和細胞增殖所必需的。在機制上，AGPG結合并穩定 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（PFKFB3），通過(guò)阻止APC/C介導的泛素化，AGPG 保護PFKFB3免受蛋白酶體降解，導致PFKFB3在癌細胞中積累，隨后激活糖酵解通量并促進(jìn)細胞周期進(jìn)程。AGPG也是p53的轉錄靶標;TP53的缺失或突變會(huì )觸發(fā)AGPG的顯著(zhù)上調。值得注意的是，抑制AGPG會(huì )顯著(zhù)損害患者來(lái)源的異種移植物（PDX）模型中的腫瘤生長(cháng)。臨床上，AGPG在許多癌癥中高表達，AGPG高表達水平與預后不良相關(guān)，提示AGPG是一種潛在的生物標志物和癌癥治療靶點(diǎn)。

圖3. 敲低AGPG抑制腫瘤形成抑制增殖和下游基因表達

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圖4. 和元生物VPack系統LncRNA表達及感染效果圖

四、CRISPR/Cas9技術(shù)介導基因敲除

★文章標題：A novel protein RASON encoded by a lncRNA controls  oncogenic RAS signaling in KRAS mutant cancers

★發(fā)表期刊：Cell Research

★作者單位：南京大學(xué)

作者報道了RASON是一種由LINC00673編碼的新型蛋白質(zhì)，是致癌RAS信號轉導的正調節因子。RASON在胰腺導管腺癌（PDAC）患者中異常過(guò)表達，在體外促進(jìn)人PDAC細胞系的增殖和體內腫瘤生長(cháng)。CRISPR/Cas9介導的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導的腫瘤轉化。Rason的基因缺失消除了LSL-KrasG12D Trp53R172H/+型小鼠中致癌基因KRAS驅動(dòng)的胰腺癌和肺癌發(fā)生。從機制上講，RASON直接與KRASG12D/V結合并抑制內源的和GTP酶激活蛋白（GAP）介導的GTP水解，從而維持KRASG12D/V處于 GTP結合的活躍狀態(tài)。在治療上，敲除 RASON會(huì )使KRAS突變的胰腺癌細胞和患者來(lái)源的類(lèi)器官對EGFR抑制劑敏感。以上研究結果表明，RASON是致癌基因KRAS信號轉導的關(guān)鍵調節因子，也是一個(gè)KRAS突變癌癥的有前途的治療靶點(diǎn)。

圖5. CRISPR/Cas9介導的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導的腫瘤轉化

五、CRISPRa技術(shù)實(shí)現內源性轉錄激活

除了可以基因敲除外，CRISPR技術(shù)也可以對內源基因的轉錄進(jìn)行激活。利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因的敲除、插入、替換依賴(lài)的是Cas9蛋白切割DNA的能力，而如果人為突變RuvC1、HNH兩個(gè)剪切位點(diǎn)，Cas9蛋白的切割能力損失成為dCas9蛋白，但仍可以與gRNA結合形成復合物。dCas9和gRNA復合物可以結合在DNA的特定位置上，在此基礎上，研究人員在復合物的后方連接一些轉錄調控元件，如轉錄激活的VP64、VP16元件等，同時(shí)將復合物錨定在基因轉錄起始區域的上游，即可實(shí)現對特定基因的轉錄激活。

圖6. SAM技術(shù)實(shí)現內源性基因激活

Chavez A,et al,.Nat Methods,2016

圖7. 加入gRNA后mCherry表達明顯增強

總的來(lái)說(shuō)，慢病毒載體在基因調控中具有穩定的基因傳遞和表達能力，可實(shí)現對外源基因的可控和特異性表達，為基因研究、基因治療和細胞工程等領(lǐng)域提供了強大的工具和平臺。

和元生物有幸提供本文所涉及的慢病毒包裝服務(wù)

和元生物提供上述設計和定制病毒載體到包裝和純化病毒顆粒服務(wù)。

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慢病毒活動(dòng)

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活動(dòng)時(shí)間：即日起-2024.4.30

活動(dòng)范圍：全國生物相關(guān)終端客戶(hù)

試用裝領(lǐng)取方式：掃描下方二維碼，確認后會(huì )盡快送達。

注意事項：

1. 關(guān)注微信公眾號后參與活動(dòng)；

2. 活動(dòng)最終解釋權歸和元李記所有。

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領(lǐng)取方式：3個(gè)工作日內聯(lián)系相關(guān)業(yè)務(wù)員進(jìn)行兌換，逾期視為自動(dòng)放棄

活動(dòng)范圍：全國生物相關(guān)終端客戶(hù)

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1. 關(guān)注微信公眾號后回復“慢病毒"參與活動(dòng)；

2. 兩張門(mén)票價(jià)值在1000元以?xún)?，若有超出部分，可自行補差價(jià)；

3. 門(mén)票使用截止到2024年5月6日，可轉贈，逾期視為自動(dòng)放棄；

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5. 若中jiang者不符合領(lǐng)取條件，本次名額將計入下一場(chǎng)chou獎（獎品不變），可關(guān)注公眾號獲取最新活動(dòng)；

6. 活動(dòng)最終解釋權歸和元李記所有。