雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒實(shí)驗原理與應用方向（雙熒光素酶活動(dòng)）

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— 實(shí)驗原理 —

螢火蟲(chóng)熒光素酶是一種分子量約為61KD的蛋白，在A(yíng)TP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過(guò)程中，會(huì )發(fā)出生物熒光。

圖1.螢火蟲(chóng)熒光素酶催化反應原理

海腎熒光素酶是一種分子量約為36KD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過(guò)程中也會(huì )發(fā)出生物熒光。

圖2.海腎熒光素酶催化反應原理

雙熒光素酶報告基因檢測系統在細胞中同時(shí)表達螢火蟲(chóng)螢光素酶和海腎螢光素酶，螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報告基因反應目的基因表達的改變，海腎螢光素酶作為內參基因，提供轉錄效率的對照（減少內在變化因素如培養細胞的數目，細胞轉染和裂解的效率對實(shí)驗準確性的影響）。兩種熒光素酶沒(méi)有種屬同源性并對應不同的反應底物，故而沒(méi)有交叉干擾。

— 應用方向 —

一、靶基因驗證

miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻譯），將目的基因3’UTR（野生型和結合位點(diǎn)突變型）序列構建至載體中報告基因Luc的3’端，通過(guò)比較過(guò)表達miRNA后，報告基因表達的改變（螢光素酶的活性下降還是不變），明確miRNA的作用及miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

圖3.靶基因驗證實(shí)驗設計原理

相關(guān)實(shí)驗適用類(lèi)型：miRNA-靶基因（mRNA、LncRNA、circRNA）、m6A位點(diǎn)、增強子

二、啟動(dòng)子活性驗證

轉錄因子主要通過(guò)作用于靶基因的啟動(dòng)子起作用，將目的基因啟動(dòng)子區序列構建在報告基因Luc的5’端，通過(guò)共表達轉錄因子后，根據報告基因表達的改變，來(lái)確定轉錄因子與靶基因啟動(dòng)子結合位點(diǎn)及對靶基因的作用。

圖4.啟動(dòng)子驗證實(shí)驗設計原理

— 應用示例 —

1、示例一

文章標題：METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination

發(fā)表期刊：Journal of cellular and molecular medicine

和元助力：將WT TRIM9-3’UTR 和突變型 TRIM9-3‘UTR 構建至pMIR-REPORT載體，通過(guò)共轉染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC，明確了miR-29c-3p與TRIM9的結合。

2、示例二

文章標題：The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer

發(fā)表期刊：Nature communications

和元助力：為了闡明MYCN轉錄調控的分子機制，作者分別將ELAVL3的全長(cháng)以及Segments A, B, C的啟動(dòng)子構建到luciferase報告基因載體上。通過(guò)雙熒光素酶報告基因實(shí)驗，發(fā)現MYCN顯著(zhù)上調full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A兩組的luciferase信號，證明了MYCN對 ELAVL3的轉錄調控。

3、示例三

文章標題：METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway

發(fā)表期刊：Cancer gene therapy

和元助力：SOCS3的CDS區，包含m6A識別位點(diǎn)野生型（GGACU）以及突變型（CCTGA），被構建在pMIR-REPORT載體上。通過(guò)過(guò)表達和干擾METTL3的表達，同時(shí)利用雙熒光素酶報告基因實(shí)驗證實(shí)了METTL3和SOCS3的相互作用。

/ 雙熒光素酶活動(dòng) /

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kai獎時(shí)間：2024年6月28日13：00

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