siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)原理

siRNA是目前基礎(chǔ)研究中常用的基因沉默（基因干擾）形式之一，方便快捷，在各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。常規(guī)siRNA產(chǎn)品為凍干粉形式的即用型試劑，-20°保存。進(jìn)行特異性靶點(diǎn)設(shè)計，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因，借助化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)適合進(jìn)行各種細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)。此外，通過對siRNA進(jìn)行特殊化學(xué)修飾，可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加高效、特異、穩(wěn)定。

siRNA轉(zhuǎn)染原理

siRNA在細(xì)胞中降解mRNA的機(jī)制與miRNA類似（如上圖），合成的siRNA通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞中，隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復(fù)合物，RISC復(fù)合物招募 AGO2，隨后正義鏈被降解，siRNA 反義鏈與互補(bǔ)配對的 mRNA 序列結(jié)合，接著 AGO2 對mRNA 進(jìn)行切割，最終引起 mRNA 的降解。

siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟（下面以 24 孔板為例，其他培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染可以咨詢李記生物）

1、接種細(xì)胞

   對于貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞按照每孔1-2x10^5個細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為60%-80% 為佳。

   對于懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，用250 μL Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基 (無血清) 重懸細(xì)胞，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，細(xì)胞密度為60-80%。

2、準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物（或轉(zhuǎn)染試劑-miRNA復(fù)合物）

   (1)對于每孔細(xì)胞，取2 μLsiRNA (20 μM，DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中，加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑與siRNA 混合，室溫孵育3 min。

   (2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清)，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

   (3)30 min后，往上述復(fù)合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清)，輕輕混勻。

3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞

   (1)細(xì)胞用PBS清洗1-2次，將上述350µL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物加入每孔細(xì)胞。

   (2)在 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-48 h，無需更換新的培養(yǎng)液，之后即可檢測基因干擾效果或者后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。注：可在轉(zhuǎn)染12h后補(bǔ)充500 μL培養(yǎng)基。

siRNA轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

siRNA沉默效果分析siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，siRNA 在  細(xì)胞內(nèi)一系列酶的作用下形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物，識別并切割靶基因mRNA，誘發(fā)宿主細(xì)胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)， 從而抑制了細(xì)胞內(nèi)目的基因蛋白的表達(dá)，一般可從兩個方面進(jìn)行檢測。

 • mRNA 水平 - QPCR檢測

  siRNA的作用機(jī)理在于其引起靶基因mRNA的降解，因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時后即可檢測到靶mRNA水平的降低，可采用細(xì)胞總RNA提取，全長cDNA合成，熒光定量實(shí)驗(yàn)即可檢測到mRNA 的敲除效率。

 • 蛋白水平 - WB檢測

  siRNA引起靶基因mRNA的降解，從而影響了靶蛋白的表達(dá)。但蛋白水平檢測時間受細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調(diào)控等因素的影響，蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關(guān)系。一般在轉(zhuǎn)染后48后開始WB檢測，72，96 小時，甚至更長時間之后多點(diǎn)采樣。