關(guān)于高保真DNA聚合酶的應用領(lǐng)域

 

  高保真DNA聚合酶真性的一個(gè)通用標準是錯配率，錯配率越低保真性越好，普通Taq酶的錯配率在10-5堿基/循環(huán)數，而高保真Taq酶錯配率可降到10-6數量級，大大降低了出錯的可能性；它適合對PCR保真性要求較高的實(shí)驗，如基因篩選、測序、突變檢測等。

 

  高保真DNA聚合酶理化性質(zhì)，純化的DNApolⅠ由一條多肽鏈組成，約含1000個(gè)氨基酸殘基，MW為109KD。分子含有一個(gè)二硫鍵和一個(gè)-SH基。通過(guò)二個(gè)酶分子上的-SH基與Hg2+結合產(chǎn)生二聚體，仍有活性。每個(gè)酶分子中含有一個(gè)Zn2+，在DNA聚合反應起著(zhù)很重要的作用。每個(gè)大腸桿菌細胞中含有約400個(gè)分子，每個(gè)分子每分鐘在37℃下能催化667個(gè)核苷酸摻入正在生長(cháng)的DNA鏈。經(jīng)過(guò)枯草桿菌蛋白酶處理后，酶分子分裂成兩個(gè)片段，大片段分子量為76KD，通常稱(chēng)為Klenow片段，小片段的分子量為34KD。此酶的模板專(zhuān)一性和底物專(zhuān)一性均較差，它可以用人工合成的RNA作為模板，也可以用核苷酸為底物。在無(wú)模板和引物時(shí)還可以從頭合成同聚物或異聚物。

 

  高保真DNA聚合酶保真原理是，高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶的活性，PCR擴增途中如果產(chǎn)生了錯配的堿基，它可以將其切掉，從而保證了擴增的準確性；需要提醒的是由于此酶具有核酸外切酶功能，往往擴增效率低一些，有的還會(huì )降解引物，而且產(chǎn)物一般不宜用TA或UA克隆法克隆。高保真DNA聚合酶的外切活性會(huì )導致PCR反應之后不會(huì )加尾，所以如果要進(jìn)行TA克隆，要先進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收（否則影響加尾），然后回收產(chǎn)物用普通Taq酶72度保溫一段時(shí)間，從而利用普通Taq酶加尾的活性。具有zui高的保真度和zui強的擴增能力，高保真DNA Polymerase，其保真度是Taq DNA Polymerase的52倍，是Pfu DNA Polymerase的6倍，擴增速度是常規聚合酶的4-150倍。