高保真DNA聚合酶的使用方案

由于不具有 3'-5'外切酶活性，因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒(méi)有校正功能。還具有非模板依賴(lài)性活性，可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈 3'加入單核苷酸尾，故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾。另一方面，在僅有dTTP存在時(shí)，它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾，產(chǎn)生 3'端突出的單 T 核苷酸尾。應用這一特性，可實(shí)現 PCR 產(chǎn)物的 T-A 克隆法。適用于，普通PCR，TA 克隆 Super Taq DNA 聚合酶 Super Taq DNA 聚合酶是由耐熱的 Taq DNA 聚合酶和具有 3’-5’外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶按照合適的比例混合而成，具有擴增效率高和錯配率低的優(yōu)良性能，使用該 產(chǎn)品擴增得到的 PCR 產(chǎn)物的 3’末端附有一個(gè)“A”堿基，可直接用于 TA 克隆。

  高保真DNA聚合酶產(chǎn)品描述，本酶為Pyrococcus furiosus中分離的pfu DNA pol基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達后經(jīng)多步純化分離而得。Pfu DNA聚合酶具有3′→5′外 切酶(校正)活性，當聚合反應發(fā)生堿基錯配時(shí)，聚合酶的校正活性可將錯配的堿基切除。Pfu DNA聚合酶為使用范圍廣的高保真DNA聚合酶，其錯誤率僅為1.3x10-6，推薦Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反應。產(chǎn)品用途，用于要求保真度比較高的PCR反應，包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成，DNA片段的補平等（參見(jiàn)實(shí)驗方案）。使用建議：Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平滑末端，無(wú)3′端"A"突出，其PCR產(chǎn) 物的克隆有幾種方案。

  高保真DNA聚合酶主要特性，此酶早在大腸桿菌中發(fā)現，以后陸續在其他原核生物及微生物中找到。這類(lèi)酶的共同性質(zhì)是，以脫氧核苷酸三磷酸（dNTP）為前體催化合成DNA。需要模板和引物的存在。不能起始合成新的DNA鏈。催化dNTP加到生長(cháng)中的DNA鏈的3'-OH末端。催化DNA合成的方向是5'→3'。PCR前引物進(jìn)行5′端加磷修飾或將PCR產(chǎn)物磷酸化處理后再直接克隆 于平滑末端的載體中（參見(jiàn)實(shí)驗方案）引物中引入15bp與載體同源序列，利用 PCR產(chǎn)物一步定向無(wú)縫克隆試劑盒（Cat# NR001）直接連接到目的載體。pfu DNA聚合酶由于Pfu DNA聚合酶的校對活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設計引物時(shí)應適當增加引物的長(cháng)度，理想的引物長(cháng)度為20-30堿基。另外為了減少由3′→5′外切酶活性引起的引物降解，盡量在冰上配制反應體系，并后加入Pfu酶。