注意!使用ecL化學(xué)發(fā)光液一定要明白這幾點(diǎn)

    取A液和B液一定要用不同的槍頭，工作液現配現用，室溫放置數小時(shí)后仍可使用但靈敏度略有降低。用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上（推薦150μl發(fā)光液/cm2膜），使之充分接觸。室溫孵育5分鐘，準備立即壓片曝光。用平頭鑷子夾起膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的液體，留下少量工作液，不可讓膜*干燥。

    在X光膠片暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來(lái)*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白條帶面向上。在黑暗中將X感光膠片放置在包裹的保鮮膜上，根據蛋白濃度曝光適當時(shí)間（根據光強度需摸索曝光時(shí)間，一般30s-2min），顯影沖洗。注：根據經(jīng)驗，如果背景過(guò)高，可使用兩張X感光膠片同時(shí)壓片。

    ecL化學(xué)發(fā)光液的注意事項，步驟1～5可在日光燈下操作；但發(fā)光液曝露于強光下時(shí)間過(guò)久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。長(cháng)時(shí)間曝光或蛋白過(guò)量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線(xiàn)性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見(jiàn)，低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見(jiàn)但可使X光膠片曝光。不能簡(jiǎn)單以肉眼觀(guān)察判斷條帶發(fā)光時(shí)間。肉眼不可見(jiàn)的熒光實(shí)際上可持續數小時(shí)并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時(shí)。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發(fā)光和曝光。由于超敏發(fā)光液極其靈敏，強烈推薦大多數進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過(guò)高將造成高背景或沒(méi)有條帶，導致失敗。某些保鮮膜包裹印跡膜時(shí)可能會(huì )淬滅熒光，應選擇高質(zhì)量保鮮膜。使用肉眼可見(jiàn)的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可確定膠片上條帶的位置和大小。NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應避免使用NaN3，如必需使用勿超過(guò)0.01%。