免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(ELISA)，是免疫學(xué)常用工具，主要應用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB實(shí)驗是先通過(guò)進(jìn)行跑電泳后，然后將分離好的蛋白質(zhì)樣品轉移到固相載體上，再利用抗原-抗體-標記物顯色來(lái)檢測樣品，常用于定性和半定量。
圖｜ WB實(shí)驗流程圖
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WB實(shí)驗常見(jiàn)十問(wèn)
1、細胞水平做WB，一般多少數量細胞提的蛋白夠做WB？做組織樣品的WB的時(shí)候,怎樣處理樣品？
答：一般5×10^6就足夠了；特殊情況需根據自己的研究來(lái)確定。
必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫)，蛋白質(zhì)溶解度會(huì )更好，離心要充分(12000轉/min，10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強，需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白變性后可以存放多久？
答：-80℃，若沒(méi)有反復取出凍融，保存一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的WB檢測嗎？
答：當然可以，有的甚至可以同時(shí)測幾十種樣品；有時(shí)如果抗體特異性高且效價(jià)高，同時(shí)使用2種一抗，可在一張膜上檢測2種不同蛋白。
4、上樣超載多少會(huì )對實(shí)驗有影響？可以用什么方法來(lái)增加上樣量？
答：正常超載30％不會(huì )有問(wèn)題的，但不建議超載加樣。
可以濃縮樣品，或者根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白，還可以考慮加大膠的厚度，以增大上樣孔體積，比如嘗試1.5mm厚的膠。
5、我所測定的蛋白分子量是100KD左右，按理說(shuō)分離膠應當采用7.5%，但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11％的配方，不知為何？
答：上述提到的兩種凝膠均可以使用，因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線(xiàn)性分辨范圍內，但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會(huì )發(fā)生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預混膠、預制膠，詳情請參考“關(guān)于蛋白電泳那些事")
6、一般一次上樣的蛋白總量是多少，跟目的蛋白的表達量有關(guān)系嗎？
答：WB一般上樣30-100μg不等，結果跟目的蛋白的表達豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(cháng)短有關(guān)。
最開(kāi)始摸條件時(shí)，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(cháng)一點(diǎn)(背景也容易就出來(lái)了)。要拿到好的結果，如果抗體好的話(huà)比較容易，抗體不好的話(huà)就需要反復測試。
7、想問(wèn)一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？
答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持冰浴，保持低溫。除非有文獻特別指明必須使用特殊方法，一般來(lái)說(shuō)沒(méi)有區別。
8、轉膜后經(jīng)麗春紅染色的條帶，為什么大蛋白分子的一端的轉膜表現不是很好？
答：這是正常的，大分子的蛋白轉移很慢，你延長(cháng)轉移時(shí)間和電流，大分子一端就會(huì )好的多，但是小分子的就有可能會(huì )變淡(轉過(guò)的表現)。注意一點(diǎn)：麗春紅染色較好，不是你的目標蛋白成功轉移至膜上的標準，只能作為一個(gè)粗略參考。
9、做半定量WB，內參β-actin，GAPDH哪個(gè)好？
答：一般選用β-actin就可以，也可以使用GAPDH，但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。
10、請問(wèn)一下PVDF膜和NC膜的區別是什么？為什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜主要通過(guò)它膜上的正電荷和蛋白接合，有疏水作用但相對較弱，和蛋白接合較牢，不易脫落，結果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過(guò)疏水作用來(lái)和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來(lái)，結果較差。
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活動(dòng)編號：Li210810H
活動(dòng)范圍：全國生物相關(guān)終端客戶(hù)
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