分析ELISA實(shí)驗中非特異性顯色原因

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）自1971年自問(wèn)世以來(lái)，以其敏感性高，特異性強，操作簡(jiǎn)便、安全，而廣泛應用于臨床診斷，開(kāi)創(chuàng )了免疫學(xué)診斷的新紀元。但同其它免疫診斷方法一樣酶免試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會(huì )碰到非特異性問(wèn)題，本文就在實(shí)驗過(guò)程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施，消除非特異性顯色作一分析。

　　一、試劑盒特異性因素

　　1、固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種，以微量滴定板zui為常見(jiàn)[1]。它具有良好的吸附性能，孔底透明度高，空白值低，各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此，在選擇試劑盒同時(shí)要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認證，評估。

　　2、包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中，試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制，包被用抗原或抗體的純度不可能達到100%，所以有些非特異性顯色不可避免，只能盡可能提高純度，提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

　　3、包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體，是決定試劑特異性的重要方面。

　　4、封閉。是ELISA中重要的一步，目的是封閉固相載體表面尚未被所占據的空隙[2]，減少后續步驟中非特異性蛋白的干擾。

　　二、檢驗標本中含有酶標記物的干擾物

　　1、內源性干擾物：類(lèi)風(fēng)濕因子（RF）、黃疸等，類(lèi)風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體，多數為IgM類(lèi)，能充當抗原成分與固相及酶標抗體反應，從而呈現非特異性顯色。

　　黃疸血標本中常含有內源性過(guò)氧化物酶，如用辣根過(guò)氧化物酶為標記物，就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。

　　2、外源性干擾物，常常因樣品采集、貯存、處理不當造成如樣品溶血，被細菌污染，標本凝集不全等。溶血標本，紅細胞溶解破裂，釋放出血紅素形成，而血紅素中的鐵卟啉是過(guò)氧化物酶的類(lèi)似物，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP（辣根過(guò)氧化酶）[2]，有國內報道酶免HBsAg試劑檢測溶血標本時(shí)可造成假陽(yáng)性[3]。如在冰箱中保存過(guò)久，其中的IgG可發(fā)生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此，血標本在采集處理時(shí)應小心，在冰箱中保存不易過(guò)久。

　　標本凝集不全時(shí)，血清中會(huì )殘留部分纖維蛋白原，也易造成假陽(yáng)性。