Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒

產(chǎn)品描述
　　Quick Cell PCR法支原體檢測試劑盒，本試劑盒采用一對支原體特異性引物，用于對樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測。試劑盒內同時(shí)含有內參對照，用于監控PCR是否正常擴增。

　　本試劑盒與MB Zell Shield 13-0050等產(chǎn)品相比更具優(yōu)勢，替代性強，具體情況可詳見(jiàn)下文或咨詢(xún)銷(xiāo)售人員。
　　本試劑盒是一種廣譜的支原體檢測試劑盒，可以識別所有100多種至今已發(fā)現的支原體；能用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：體外細胞培養的上清；血清；各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；其他液體樣品等。具有100%支原體識別率、靈敏度*、含內參條帶從而可以區分真陰性樣品和假陰性樣品、無(wú)需配套相對昂貴的熒光定量PCR儀等優(yōu)點(diǎn)。
　　經(jīng)多次測試，本試劑盒有記錄可以識別在體外細胞培養中曾經(jīng)報道出現的20種支原體，根據文獻報道，這些支原體基本能占污染細胞的支原體種類(lèi)的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫(xiě); A.為Acholeplasma的縮寫(xiě)）。

訂購信息

【注】：
以下試劑需要自行準備：①普通的Taq DNA 聚合酶（推薦使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version，貨號：RR006A，已包含2.5 mM 的 dNTP）和相應的緩沖液；② 2.5 mM的dNTP；③DNA上樣緩沖液（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047，該緩沖液已含無(wú)毒核酸染料，不需要接觸 EB 等致癌物質(zhì)）。
運輸與保存條件
　　冰袋運輸，-20℃保存，可以保存五年。
使用方法
1.待測樣品的準備
取換液后培養2-3 d且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞在換液傳代后，生長(cháng)2-3 d再取培養液進(jìn)行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進(jìn)行樣品的前處理：
方法一
（1）取 150μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm 低速離心5 min；
（2）上述離心上清液，95 ℃加熱處理5 min（可以轉移到 PCR 管內，在 PCR 儀上進(jìn)行加熱處理），簡(jiǎn)單離心（1000g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測。
方法二（推薦本方法，有高速離心機的的可選用本方法，可以去PCR抑制物，準確性更高。）
（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，普通臺式離心機1000 rpm 離心5 min，將離心后的上清轉移到另一個(gè)離心管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 min，小心吸走全部上清，用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推薦使用，樣品可以長(cháng)期保存）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸、沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進(jìn)行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進(jìn)行加熱處理），簡(jiǎn)單離心（1000g，5 s）后，取上清進(jìn)行檢測。
【注】：
① 這里的細胞培養上清不是指細胞經(jīng)*酶消化后的離心上清，而是指至少培養 2 d后的貼壁細胞培養液上清或懸浮細胞培養液；
② 本步驟的低速離心是為了去除哺乳動(dòng)物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動(dòng)物細胞將被沉淀下來(lái)而支原體不會(huì )；
③ 收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存；
④ 如果預期待測樣品支原體含量較少（比如低溫保存的血清、臍帶血、*mei、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個(gè)別細胞培養上清等），可以采取措施以提高檢測的靈敏度，具體方法請看后文注意事項部分：如何提高本試劑盒檢測靈敏度。
2.PCR 體系的配制  
（1）按照25μL體系配制比例如下。如果是多樣品檢測，加兩個(gè)對照樣品后各組分總體積如下表。配制好的混合液，按每管23μL分裝到0.2 mL的PCR管中。

【注】：
① 總體積中多配制 6% 是為了防止移液導致誤差，以保證每個(gè)反應管中的反應液足量；
② 如果有條件，PCR 體系的配制建議在冰上進(jìn)行操作；
③ 本試劑盒不推薦使用 2× 的 PCR mixture（內含 Taq 酶、緩沖液和 dNTP），建議使用Taq酶、10×Taq 緩沖液和 dNTP 等試劑配制PCR體系；
④ 為了避免可能的污染，收到的支原體引物和內參，可以適當分裝（比如：每支 40μL）后冷凍保存；
⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：陰性對照的 586 bp 內參條帶必須有一定亮度，且穩定性良好，否則不能使用），酶、去離子水的加入量需要根據其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行調整。
（2）加入待測樣品、陰性和陽(yáng)性對照樣品。樣品檢測管中加入2μL待測樣品，陰性對照管加入2μL去離子水，陽(yáng)性對照管加入2μL陽(yáng)性支原體 DNA。
【注】：
① 裝有陽(yáng)性支原體 DNA 的螺口管開(kāi)蓋之前，低速離心或用手指捏住，用力甩一下即可；
② 進(jìn)行反應體系配制的房間，與樣品前處理、加陽(yáng)性對照DNA、樣品DNA的房間建議分開(kāi)。
3.PCR 參數設置

4.PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳
　　配制含溴化乙錠（EB）的濃度為 1.5%的 DNA 瓊脂糖凝膠（推薦使用李記生物的GelRed預染DNA上樣緩沖液(5X)，貨號：AN34L047，該產(chǎn)品預添加了無(wú)毒安全染料）；當溴酚藍染料跑出上樣孔 3-4 cm時(shí)，停止電泳，拍照。
5.結果判斷  
PCR 擴增的結果有可能出現以下幾種情況：

　　支原體 PCR 擴增結果：586 bp 條帶為內參條帶，270 bp 左右的條帶為支原體特異條帶（各支原體的條帶大小會(huì )略有不同，總體在 266-280 bp 之間。注意：支原體特異條帶的大小不會(huì )超過(guò)該范圍。超過(guò)該范圍的，就是雜帶?。?。隨著(zhù)支原體 DNA 模板的增加，270 bp 左右的條帶會(huì )逐漸增強而 586 bp 的內參條帶會(huì )逐漸減弱，甚至消失。
　　泳道1：陰性對照或者沒(méi)有支原體污染的樣品；
　　泳道2：極重度支原體污染樣品；
　　泳道3：重度污染樣品；
　　泳道4：中度污染樣品；
　　泳道5：輕度污染樣品；
　　泳道6：PCR 的擴增被細胞的代謝產(chǎn)物抑制，導致擴增失敗。
　　M：DNA marker.
注意事項
1.設有陰性對照，保證本試劑盒含有的支原體引物和內參以及整個(gè)反應體系正常。
2.只有當陰性對照的結果沒(méi)有出現 270 bp 左右的支原體特異條帶時(shí)，其他樣品的檢測結果才是可信的。
3.每次試驗陰性對照中 586 bp 的內參條帶都必須出現而且要有一定的亮度，才說(shuō)明試驗成功。如果陰性對照的內參條帶經(jīng)常沒(méi)有出現或者非常弱，說(shuō)明試驗不成功，這時(shí)可以采取以下幾個(gè)措施： a.請使用普通蒸餾水或去離子水。不能使用去內毒素的水、DEPC 處理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水，這幾種水都可能會(huì )抑制 PCR 擴增的效率。 b.請使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version（推薦。貨號： RR006A，可用 400 次）。 c.可以嘗試增加 PCR 的循環(huán)數，比如：由原來(lái)的 40 個(gè)循環(huán)，增加到 45 個(gè)循環(huán)。如果采取以上幾個(gè)措施后，陰性對照的內參條帶仍然經(jīng)常沒(méi)有出現或者非常弱，請聯(lián)系廠(chǎng)家解決。
4.如果直接使用細胞培養液上清進(jìn)行檢測，而檢測結果顯示該樣品 586 bp 條帶和 270 bp 左右的條帶都沒(méi)有出現（如圖 1，泳道 6）或者內參條帶非常微弱，在排除 PCR試劑的問(wèn)題后,說(shuō)明該樣品含有抑制 PCR 擴增的代謝產(chǎn)物。
5.防 DNA 污染注意事項： a.強烈建議所有操作全部使用進(jìn)口濾芯吸頭（比如：Axygen 濾芯吸頭）進(jìn)行操作，以免試劑被污染。 b.“PCR 體系配制的房間、移液槍"（不要使用細胞培養室的移液槍?zhuān)。┖汀癙CR 產(chǎn)物的電泳房間、移液槍"一定要分開(kāi)，不能在同一個(gè)房間進(jìn)行，也不能使用相同的移液槍進(jìn)行操作。 c.PCR 產(chǎn)物是導致假陽(yáng)性的主要原因，PCR 產(chǎn)物不要在 PCR 體系配制的房間中打開(kāi)。 d.樣品處理的房間和移液槍?zhuān)缬袟l件，建議也分開(kāi)。 e.收到的支原體引物和內參，可以分裝（比如 40 μL一支）后保存。
6.如發(fā)現細胞被支原體污染，推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預防試劑盒，貨號：AC16L066；以及EZ 水浴鍋抑菌劑，貨號：AC16L162 和 EZ 細胞房除菌劑，貨號：AC16L143。產(chǎn)品詳情可咨詢(xún)銷(xiāo)售人員或見(jiàn)李記生物網(wǎng)站。
7.支原體檢測樣品可以分成兩類(lèi)：①用含血清的培養液培養的哺乳動(dòng)物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長(cháng)，培養數天后，支原體密度一般較高，可達 10^7-9/mL，可以直接檢測。②低溫保存的血漿、血清、臍帶血、*酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，往往檢測不出來(lái)。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進(jìn)行離心濃縮處理；（2）使用支原體液體培養基（必須同時(shí)接種不含jing氨酸和含jing氨酸的兩種支原體液體培養基）培養 3-7 d后，再進(jìn)行檢測。具體方法請參考李記生物 Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒，貨號：AC16L062 說(shuō)明書(shū)中后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要 3-7 d，但是可靠性高。
8.該產(chǎn)品主要用于細胞上清支原體污染檢測，僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
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