雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒

      螢火蟲(chóng)熒光素酶是一種分子量約為61 kD 的蛋白，在A(yíng)TP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin，在Luciferin 氧化的過(guò)程中，會(huì )發(fā)出生物熒光(Bioluminescence)。海腎熒光素酶是一種分子量約為36 kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide，在Coelenterazine 氧化的過(guò)程中也會(huì )發(fā)出生物熒光。生物熒光可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀(Luminometer)或液閃測定儀進(jìn)行測定。

　　在 DLR 檢測中，螢火蟲(chóng)（Firefly）熒光素酶和海腎（Renilla）熒光素酶的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測。先是先以熒光素(Luciferin)為底物來(lái)檢測螢火蟲(chóng)熒光素酶(Firefly Luciferase)，后以腸腔素(Coelenterazine)為底物來(lái)檢測海腎熒光素酶(Renilla Luciferase)，并在后續加入海腎熒光素酶底物時(shí)，同時(shí)加入抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶催化Luciferin發(fā)光的物質(zhì)，使后續檢測僅僅檢測到海腎熒光素酶的活性，實(shí)現雙熒光素酶報告基因檢測。通過(guò)熒光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉錄調控元件或5' 啟動(dòng)子區克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區克隆在Luciferase 的下游等，構建成報告基因(Reporter Gene)質(zhì)粒，然后轉染細胞，用適當藥物等處理細胞后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過(guò)熒光素酶活性的高低來(lái)判斷藥物處理等對目的基因的轉錄調控作用。 Renilla Luciferase 相對更多地被用作轉染效率的內參，以消除細胞數量和轉染效率的差異。

　　具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無(wú)細胞內源活性干擾等特點(diǎn)。

訂購信息

試劑盒組分

保存方法

藍冰運輸。-20℃保存，有效期12個(gè)月。

【注】：C組分建議預先使用B組分配制為2 mg/mL儲液，B組分、D組分及配制為儲液的C組分，根據實(shí)驗需求進(jìn)行小批量分裝。所有檢測工作液建議現配現用，避免反復凍融。

使用方法
1.細胞裂解
（1）將轉入報告基因的細胞中的培養基移除，加PBS 輕輕洗滌兩次（貼壁細胞可直接進(jìn)行此操作，懸浮細胞要離心收集細胞）。按如下方案加入 1×Lysis Buffer (用無(wú)菌水按 4:1 稀             釋 A 組分)， 然后將培養板放在微型震蕩器上室溫震蕩 15 min，充分裂解細胞。

 注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h，-70℃可長(cháng)期存放（裂解產(chǎn)物不能多次反復凍融）。如果熒光素酶的表達水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以小為  100μL。

（2）將充分裂解后的裂解產(chǎn)物，10000-15000 rpm 離心 3-5 min。離心后將上清液移入新的 EP 管中進(jìn)行后續檢測。

（3）細胞裂解后可以立即測定熒光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進(jìn)行測定。

2. 工作液配制

（1）用B 組分充分溶解C 組分，配制成0.2 mg/mL的螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測液。

注：螢火蟲(chóng)熒光素酶工作液不能反復凍融，若單次實(shí)驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規格。

（2）用D組分將E組分稀釋成1× Coelenterazine工作液，稀釋方法為將1 µL E組分加入到49 µL D組分中，此稀釋方法可按比例相應擴大。

注：1× Coelenterazine工作液應該現用現配。
3. 化學(xué)發(fā)光值檢測

（1）將上述配制好的螢火蟲(chóng)熒光素檢測液和1× Coelenterazine工作液恢復至室溫。

（2）按儀器操作說(shuō)明書(shū)開(kāi)啟化學(xué)發(fā)光儀或具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標儀，將測定間隔設為2 s，測定時(shí)間設為10 s。

（3）每個(gè)樣品測定時(shí)，取樣品20-100μL(如果樣品量足夠，請加入100μL；如果樣品量不足可以適當減少用量，但同批樣品的使用量宜保持一致)。

（4）加入100μL螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測試劑，用槍打勻或用其它適當方式混勻后測定RLU(relative light unit)。以報告基因細胞裂解液為空白對照。

注：由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光，建議加入螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測試劑后，立即進(jìn)行發(fā)光值的檢測。

（5）在完成上述測定螢火蟲(chóng)熒光素酶步驟后，加入 100 μL海腎熒光素酶檢測工作液，用槍打勻或用其它適當方式混勻后測定RLU(relative light unit)。

（6）在以海腎熒光素酶為內參的情況下，用螢火蟲(chóng)熒光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎熒光素酶測定得到的 RLU 值。根據得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲(chóng)熒光素酶為內參，也可以進(jìn)行類(lèi)似計算。

注意事項
1. 為取得理想測定效果，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時(shí)，樣品和測定試劑混合后到測定前的時(shí)間應盡量控制一致；使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標儀時(shí)，宜先把樣品全部加好，然后統一加入螢火蟲(chóng)熒光素酶檢測試劑。

2. 由于溫度對酶反應有影響，所以測定時(shí)樣品和試劑均需達到室溫后再進(jìn)行測定

3. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。