Zeocin (博萊霉素)

Zeocin (博萊霉素)Zeocin即phleomycin D1，中文名稱(chēng)博來(lái)霉素或者腐草霉素D1，是從輪狀鏈霉菌(Streptomyces verticillus)的一個(gè)突變體菌株中分離而來(lái)的博來(lái)霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成員。它對細菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳動(dòng)物細胞均有抑制作用和細胞毒性。

Zeocin是一種堿性、水溶性的、銅離子螯合的糖肽抗生素。Cu2+螯合的Zeocin溶液呈現藍色，無(wú)活性。當其進(jìn)入細胞后，Zeocin上的Cu2+被還原為一價(jià)銅離子(Cu+)，并被細胞內的巰基化合物(sulfhydryl compound)清除，導致Zeocin被活化，能夠結合到細胞內DNA上并使其斷裂，最終導致細胞死亡。

對Zeocin產(chǎn)生抗性的蛋白是來(lái)源于印度鏈球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因編碼一種14kDa大小的蛋白，它能夠以一定比率結合Zeocin，使其不能結合細胞DNA，抑制其DNA斷裂活性，從而使細胞對Zeocin產(chǎn)生抗性。因此，Zeocin可用來(lái)篩選表達Zeocin抗性基因的多克隆或單克隆細胞，或用于相應的多克隆或單克隆細胞的維持性培養。

Zeocin對于絕大多數好氧細胞均有效，常用于細菌(如大腸桿菌)、真核微生物(如酵母)及動(dòng)植物細胞的篩選。大腸桿菌篩選推薦濃度為25~50μg/ml (低鹽LB培養基，NaCl濃度不能超過(guò)5g/L)；酵母篩選推薦濃度為50~300ug/ml (YPD或基本培養基)；哺乳動(dòng)物細胞篩選推薦濃度為50~1000ug/ml (合適培養基，根據細胞系的類(lèi)型而不同)。實(shí)際應用時(shí)，應針對不同的細胞系測試Zeocin的濃度梯度，以確定最佳使用濃度。

訂購信息

藍冰運輸。-20℃避光保存，有效期12個(gè)月?！咀ⅰ浚罕苊夥磸蛢鋈?。

技術(shù)參數

1.CAS：11006-33-0

2.分子式：C55H85O21N20S2Cu

3.分子量：1474.03

4.溶解性：H2O: 50 mg/mL

5.結構式：

使用方法

1.細菌的篩選(以大腸桿菌為例)
（1）使用不含Tn5轉座子元件的宿主細胞DH5和DH10等進(jìn)行篩選
（2）需使用低鹽LB培養基(10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，調整pH至7.5，加水定容至1L)以維持Zeocin的活性。
（3）Zeocin篩選的推薦濃度為25~50μg/ml。
2.真菌的篩選(以酵母為例)
（1）適用于釀酒酵母和畢赤酵母。
（2）培養基的選擇：含1M山梨醇的YPD培養基(適用于電穿孔法轉染細胞)；YPD或基本培養基(適用于化學(xué)法轉染細胞)。調整培養基pH至6.5~8.0，并選擇使用zui低有效濃度的Zeocin進(jìn)行篩選。
（3）轉染方法：需使用電穿孔或鋰離子轉染法。不要使用酵母原生質(zhì)球(spheroplasting)進(jìn)行Zeocin抗性的轉染及篩選，因為Zeocin會(huì )導致原生質(zhì)球的*死亡。
（4）Zeocin篩選的推薦濃度為50~300μg/ml。具體濃度與酵母菌株、培養基pH以及離子強度有關(guān)。
3.哺乳動(dòng)物穩定表達細胞株的篩選
　Zeocin用于哺乳動(dòng)物細胞篩選常用濃度為50-1000μg/ml (平均常用濃度為250-400μg/ml)。影響篩選濃度的主要因素包括離子強度、細胞類(lèi)型、細胞生長(cháng)密度以及生長(cháng)速率。根據細胞類(lèi)型的不同，需要1-2周可以篩選到Zeocin抗性的細胞。在篩選穩定表達細胞株之前，需要先確定能夠殺死未轉染細胞的Zeocin最佳工作濃度。Zeocin的最佳工作濃度需要通過(guò)劑量效應曲線(xiàn)來(lái)確定。下表中列出了部分細胞中Zeocin的篩選濃度范圍以供參考。

表1.部分常見(jiàn)哺乳動(dòng)物細胞的Zeocin推薦篩選濃度表

 （1）細胞對Zeocin敏感性的確定(殺滅曲線(xiàn)的建立)

①接種細胞使得細胞密度約為25%，按照8、16或24個(gè)細胞培養孔(分別為單個(gè)培養孔、復孔和三復孔)準備培養的細胞，培養24h。
②去除細胞培養液，換成含不同濃度Zeocin的新鮮篩選培養液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/ml)。
③每2-4天更換新鮮的篩選培養液，觀(guān)察存活細胞的比例，選擇在1-2周內殺死所有細胞的zui低濃度作為最佳工作濃度。
（2）篩選Zeocin抗性的穩定細胞株
①按照20%-30%的細胞密度接種細胞，培養過(guò)夜。
②轉染攜帶Zeocin抗性基因的質(zhì)?；蚋腥緮y帶Zeocin抗性基因的病毒，同時(shí)設置沒(méi)有轉染質(zhì)?；蚋腥静《镜募毎鳛閷φ?。說(shuō)明：沒(méi)有轉染質(zhì)?；蚋腥静《镜募毎?，也需要同樣進(jìn)行轉染質(zhì)?；蚋腥静《镜南鄳獙?shí)驗操作。
③轉染或感染48-72 h后，換成含有最佳工作濃度的Zeocin (由步驟a中的殺滅曲線(xiàn)確定)的新鮮培養液，繼續培養。如果有必要，可以對細胞進(jìn)行傳代，略稀釋后進(jìn)行篩選培養。
④每2-4天更換含有Zeocin的新鮮篩選培養液。
⑤對照組正常細胞100%死亡，Zeocin抗性組中存活的細胞即為表達Zeocin抗性基因的細胞。然后根據實(shí)驗目的進(jìn)行多克隆或單克隆細胞的篩選。根據細胞種類(lèi)和轉染/篩選效率，單克隆細胞株的形成可能需要一周或更多的時(shí)間。
【注】：若待篩選細胞對Zeocin的抗性明顯強于大部分細胞，則按照以下方法克服此類(lèi)耐受性：用含Zeocin培養液進(jìn)行細胞接種培養，置于37℃孵育2-3 h，使得細胞貼壁。然后將細胞置于4℃，2 h。需要使用HEPES作為培養基的緩沖體系。重新將細胞置于37℃孵育。4℃孵育細胞的目的是短時(shí)間內終止細胞分化，使得Zeocin能發(fā)揮作用，殺死細胞。
（3）穩定細胞株的維持培養
可采取如下幾種方式之一來(lái)維持培養穩定細胞株：
①使用含有與上述篩選穩定轉染細胞株相同濃度的Zeocin篩選培養液來(lái)維持培養。
②降低Zeocin濃度為篩選濃度的一半進(jìn)行維持培養。
③使用剛好能預防敏感細胞生長(cháng)但不足以致死的Zeocin濃度來(lái)維持培養(根據殺滅曲線(xiàn)來(lái)判斷)。

注意事項

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.用于細胞實(shí)驗，溶解后，須用一次性針頭濾器過(guò)濾除菌。

3.Zeocin人體有害，操作時(shí)請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內。

4.Zeocin對光敏感，需避光保存于-20℃。含有該抗生素的平板或培養基也需避光保存。

5.高離子強度、酸或堿性都會(huì )抑制Zeocin的活性，該抗生素在過(guò)高或過(guò)低pH及弱氧化劑的條件下不穩定，且變性不可逆。在培養細菌時(shí)，需適當降低細菌培養基的鹽濃度(低鹽LB培養基，NaCl濃度不能超過(guò)5g/L)并調整pH至7.5，從而使其保持活性。

6.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

7.抗生素不穩定，請在有效期內盡快使用。
8.以上數據均來(lái)自公開(kāi)文獻，李記生物暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨立驗證，僅供參考。

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