PEI細胞轉染液使用方法

使用方法

1. 接種細胞：用膠原酶消化細胞并計數（不建議用胰酶）。轉染前18-24小時(shí)進(jìn)行細胞的鋪板，以便在轉染時(shí)，貼壁細胞的密度大約在80%左右。注：培養液中的血清和抗生素不影響轉染效率。

    2.   準備 EZ Trans-DNA 復合物

        （1）轉染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面，以轉染24孔板培養皿為例，說(shuō)明轉染的具體方法（如果在別的培養器皿中進(jìn)行轉染，各試劑建議使用量見(jiàn)表1.：

       （2）將1 μg 質(zhì)粒DNA稀釋到40 μL無(wú)血清的高糖DMEM培養基，用移液槍吹吸3-4次。

       （3）將3 μL EZ Trans轉染試劑稀釋到40 μL無(wú)血清的高糖DMEM培養基，用移液槍吹吸3-4次。

      注：無(wú)血清的高糖DMEM培養基是稀釋液，不能使用含血清的培養基（包括Opti-MEM）進(jìn)行DNA和EZ Trans轉染試劑的稀釋?zhuān)∫驗镋Z Trans-DNA轉染復合物的形成過(guò)程不能含有血清。

       （4）將稀釋好的EZ Trans轉染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質(zhì)粒DNA中，立即用移液槍吹吸3-4次。

     注：此混合的順序不能反向進(jìn)行！

      （5）室溫放置10-15分鐘，以形成EZ Trans-DNA復合物。

表1：不同培養體積對應的待轉DNA、EZ Trans、稀釋液用量

3.   轉染細胞

1. 將上述80 μL EZ Trans-DNA轉染復合物均勻滴入到含細胞的培養皿中。輕輕晃動(dòng)培養皿或輕微渦旋，讓EZ Trans-DNA復合物分散均勻。
2. 在 CO₂培養箱中 37℃下孵育細胞，轉染后12-18小時(shí)，去除含EZ Trans-DNA復合物的培養液。（若細胞形態(tài)欠佳，可在轉染3-5h后，添加1/2體積的包含30%血清的生長(cháng)培養基，在轉染12-18小時(shí)后*去除含EZ Trans-DNA復合物的培養液，用含血清和抗生素的新鮮培養液。）
3. 轉染后zui快7h即可檢測到轉入基因的表達，可根據需要在24-48小時(shí)內檢測轉染效率。

      注：篩選穩定轉染細胞株，可在上述操作后（轉染細胞24小時(shí)后），將細胞傳代至新鮮的生長(cháng)培養基中（將細胞稀釋10倍以上），在 CO₂培養箱中 37℃孵育過(guò)夜。在有轉染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下，約 1～2周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(cháng)培養基。

運輸與保存方法

       常溫運輸，4℃保存，保質(zhì)期12個(gè)月。

使用注意事項

       質(zhì)粒質(zhì)量：請務(wù)必使用高質(zhì)量轉染級無(wú)內毒素質(zhì)粒。通過(guò)260 nm光吸收測定DNA 濃度，260nm / 280nm比值確定 DNA 純度（比值應該在1.8～2.0的范圍之內）。如有可能，請通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒的完整性。

      細胞條件：使用適當保存和經(jīng)常傳代的健康細胞。確保培養基沒(méi)有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞，請在轉染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養細胞。

特別提醒

1. 對于某些類(lèi)型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞，在轉染前兩天鋪板可顯著(zhù)提高轉入基因的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉染時(shí)細胞的匯合度仍為70～80%。

2. 對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。

3. 即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復合物仍能轉染細胞，但是DNA-PEI復合物必須在無(wú)蛋白存在的條件下形成。

4. 對大多數細胞來(lái)而言，每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA使用 1～4μL體積線(xiàn)性PEI轉染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

EZ Trans轉染液用于不同細胞轉染時(shí)用量參考（以96孔板為例）