支原體快速檢測試劑盒（細胞培養）

《Quick Cell快速支原體檢測試劑盒》主要用于檢測細胞培養上清或別的液體樣品（如血清）中是否含有支原體污染，該試劑盒僅用于基礎科研。

哺乳動(dòng)物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個(gè)世界性的問(wèn)題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實(shí)驗結果的不準確、甚至*錯誤。從2013年開(kāi)始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進(jìn)行支原體檢測。本試劑盒可以檢測：（1）M.Hyorhinis、（2）M.Fermentans、（3）M.Arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）Acholeplasma Laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M.bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis等幾乎所有常見(jiàn)的污染細胞的支原體（注：M.為Mycoplasma的縮寫(xiě)）。以上13種支原體約占細胞支原體污染的99%以上，本試劑盒產(chǎn)品全部可以檢測。絕大多數支原體污染集中于前8種。注意：本試劑盒無(wú)法檢測Ureaplasma Urealyticum支原體！Ureaplasma Urealyticum在支原體污染種極其罕見(jiàn)。

與PCR法檢測支原體比較，本試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢優(yōu)勢顯著(zhù)：

試劑盒組成

（1）溶液Ⅰ：1150 μL （50次檢測）

（2）溶液Ⅱ：50 μL（50次檢測）

（3）溶液Ⅲ：指示劑，50 μL（50次檢測）

（4）陽(yáng)性支原體DNA：50 μL

（5）礦物油：1500 μL

使用方法

1. 待測樣品的準備：為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品來(lái)源于至少培養三天且匯合度在70-90%左右的細胞培養上清（貼壁細胞），無(wú)需離心。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長(cháng)3天再取培養液進(jìn)行檢測，也無(wú)需離心。哺乳動(dòng)物細胞的存在不會(huì )影響檢測結果。

注：收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個(gè)月，在-80℃可以長(cháng)期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時(shí)間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2. 反應體系的配制

表1：恒溫反應體系的配制

（1）將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，待其融化后（可在37 ℃ 水浴內放置5-10分鐘以幫助融化），從-20℃冰箱中取出溶液Ⅱ置于冰上。吹吸均勻后，按表1比例，混合溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。如有多個(gè)樣品，為了防止移液誤差，建議溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ用量乘以系數1.08，保證每個(gè)反應管中的反應液足量。從配液開(kāi)始的所有步驟，均在冰上操作。

舉例：如果待測樣品為3個(gè)（加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽(yáng)性對照），則樣品總數為5個(gè)。溶液Ⅰ的總體積為23×5×1.08=124.2μL，溶液Ⅱ的總體積為1×5×1.08=5.4μL，溶液Ⅲ的總體積為0.18×5×1.08=0.972 μL將溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合均勻。

注：溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存，并在操作時(shí)置于冰上。溶液Ⅱ即使在-20 ℃條件下仍為液態(tài)，不需置于室溫。

（2）將上述配制好的反應體系，吹打均勻后，按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。盡量保證每管的反應液體積一樣。 PCR管應該使用透明度良好的薄壁PCR管。

（3）往測試管（Test）中加入1μL待測細胞培養液；往陽(yáng)性對照管（Positive）中加入1 μL陽(yáng)性支原體DNA；往陰性對照管（Negative）中加入1μL滅菌水；反應液的總體積為25 μL。

注1：裝有陽(yáng)性支原體DNA的螺口管開(kāi)蓋之前，用力甩一下，或者用迷你離心機即可。

注2：進(jìn)行反應體系配制的房間，與進(jìn)行樣品前處理、加陽(yáng)性對照DNA、樣品DNA的房間分開(kāi)。

3. 反應

PCR儀設置程序：61℃，60 min；10℃, forever；熱蓋溫度，100 ℃。

注意：若實(shí)驗室反應場(chǎng)所沒(méi)有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實(shí)際溫度的溫差不超過(guò)0.5℃，另須往每個(gè)反應管內加入25μL礦物油，以防止水份揮發(fā)，然后蓋上蓋子，將反應管插入帶孔的漂板內，放入已經(jīng)升溫到61℃的水浴內，準確反應60分鐘。

4. 結果判斷

61℃反應60分鐘后，立刻取出反應管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過(guò)反應管溶液顏色的變化，即可判斷檢測結果。如果溶液為藍綠色，則說(shuō)明有支原體污染；如果為紫紅色，則說(shuō)明沒(méi)有支原體污染（如圖1）。

注：在61℃反應的時(shí)間必須準確計時(shí)，zui多不得超過(guò)5分鐘，以免出現假陽(yáng)性。必須在反應后2小時(shí)內進(jìn)行結果判斷，避免室溫下擴增反應進(jìn)行，影響結果判別。