細胞增殖及細胞活力檢測方法

一、細胞增殖與細胞活性

　　細胞增殖是活細胞的重要?理功能之?，細胞增殖與細胞活性檢測所用的方法相近，但實(shí)驗目的不同。細胞增殖是通過(guò)細胞增殖的物質(zhì)基礎判斷細胞的數量變化，例如細胞計數法，反應的就是細胞真實(shí)的數量。而細胞活性檢測，則是通過(guò)檢測細胞受到藥物或其他措施處理后，標志物產(chǎn)量或濃度的變化，進(jìn)而判斷藥物或處理措施的作用，細胞活性檢測所得結論，往往反映了實(shí)驗設計的目的。

　　細胞增殖檢測，因檢測標志物的不同，目前大致分為四類(lèi)：DNA合成檢測、代謝活性檢測、細胞增殖相關(guān)抗原檢測和ATP濃度檢測。細胞活性檢測通常包括細胞膜對核酸染料的通透性、代謝活性、膜電位等的檢測，確定細胞的代謝活?或細胞代謝產(chǎn)物，通過(guò)檢測細胞的氧化還原活性反映細胞增殖能?。

二、常見(jiàn)細胞增殖檢測方法

1.DNA合成檢測——BrdU / EdU檢測法

　　細胞在增殖過(guò)程中，DNA的倍增，是顯著(zhù)的變化之一，通過(guò)檢測DNA量的變化，可判斷細胞數量的變化。通過(guò)檢測DNA進(jìn)行細胞增殖檢測方法，除了同位素標記DNA外，常用的就是：BrdU / EdU檢測法。BrdU(5-溴脫氧尿嘧啶核苷)是胸腺嘧啶（T）的衍生物，可代替胸腺嘧啶在摻入S期的DNA合成，然后利用抗Brdu的單克隆抗體，ICC染色，顯示增殖細胞，如果與其它細胞標記物進(jìn)行雙染，則可判斷增殖細胞的種類(lèi)，增殖速度，對研究細胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。

　　Edu檢測法是BrdU的替代方法，也是目前更廣泛適用的方法，RrdU需抗體在破開(kāi)DNA雙聯(lián)后與抗原分子集合后才能顯示，這個(gè)處理過(guò)程對細胞有損傷，而EdU同樣可以代替胸腺嘧啶（T）滲入DNA，但其分子大小只有BrdU的1/500，可以直接在DNA雙鏈形態(tài)下與染料分子結合用于檢測，無(wú)需抗體結合反應，實(shí)驗過(guò)程簡(jiǎn)單，對細胞損傷小，是新一代基于DNA檢測時(shí)報增殖的試劑。

2.代謝活性物質(zhì)檢測——MTT、CCK8

　　MTT與CCK8兩種方法都是利用檢測細胞內線(xiàn)粒體中琥珀酸脫氫酶濃度，進(jìn)而反映細胞增殖活性。MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽)被琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（formazan）并堆積在細胞內，然后以DMSO溶解甲瓚，通過(guò)檢測甲瓚的吸光度來(lái)間接反映存活細胞的相對數量。

　　CCK8中的主要物質(zhì)WST-8是一種類(lèi)似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線(xiàn)粒體內的琥珀酸脫氫酶還原生成橙黃色的、水溶性formazan。細胞增殖越多越快，則顏色越深；反之，則顏色越淺。CCK-8的原理跟MTT其實(shí)是相同的，不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的，不需要再吸出培養液加入有機溶劑溶解這個(gè)步驟，對細胞毒性小，可進(jìn)行活細胞動(dòng)態(tài)測定，試劑穩定即開(kāi)即用，重復性好于MTT。

3.細胞增殖相關(guān)抗原檢測

　　Ki-67,PCNA都是細胞增殖因子，在細胞異常增殖中均有顯著(zhù)的表達差異，是研究腫瘤細胞增殖的重要核抗原。Ki-67,PCNA均與細胞周期密切相關(guān)，通過(guò)免疫反應檢測Ki-67,PCNA可反應腫瘤細胞增殖情況。

4.ATP濃度檢測

　　細胞內的ATP是細胞能量的重要來(lái)源，其含量與細胞周期和細胞狀態(tài)關(guān)系密切，死細胞或瀕臨死亡的細胞幾乎不含ATP。在細胞中測得的ATP濃度與細胞數之間存在嚴格的線(xiàn)性關(guān)系。利用熒光素酶Luciferase及其底物熒光素Luciferin的ATP檢測以生物發(fā)光為基礎，能夠為您提供非常靈敏的結果。如果有ATP存在熒光素酶就會(huì )發(fā)光，而且其發(fā)光強度與ATP濃度成正比，這種方法非常適用于高通量細胞增殖檢測和篩選。Promega公司開(kāi)發(fā)的CellTiter-Glo Luminescent 實(shí)現了"加樣－混合－測量"的簡(jiǎn)單快速檢測模式，CellTiter-Glo試劑和細胞培養中的常用培養基兼容，如RPMI 1640, MEM, DMEM, 和Ham's F12，且不受酚紅和有機溶劑的影響，可用于高通量自動(dòng)化篩選（HTS）。

5.羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）檢測法

　　羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（CFSE）是一種可穿透細胞膜的熒光染料，具有與細胞內基質(zhì)特異性結合的琥珀酰亞胺脂基團和具有非酶促水解作用的羥基熒光素二醋酸鹽基團，CFSE進(jìn)入細胞后可以不可逆地與細胞內的氨基結合偶聯(lián)到細胞蛋白質(zhì)上。當細胞分裂時(shí)，CFSE標記熒光可平均分配至兩個(gè)子代細胞中，子代細胞熒光強度是親代細胞的一半，在一個(gè)增殖的細胞群中，各連續代細胞的熒光強度遞減，利用流式細胞儀在488nm激發(fā)光和熒光檢測通道可對其進(jìn)行分析。

三、細胞增殖/活性檢測方法比較

常見(jiàn)細胞增殖/活性檢測方法比較見(jiàn)下表（含李記生物產(chǎn)品、貨號）