如何選擇核酸染料

科研人員還在為如何選擇核酸染料而煩惱嗎？
帶您認識幾款優(yōu)秀的核酸染料

一、 李記GelRed,李記GelGreen——李記生物研發(fā)的兩款核酸染料。
據不*統計，有強烈致癌、致畸作用的EB染料仍以90%的優(yōu)勢占據核酸染料使用量多，在眾多的EB替代染料中，名氣最大的要數Life公司的SYBR系列、美國B(niǎo)iotium公司的GelRed,GelReen染料，其他替代染料要么是EB,吖啶橙改名，要么是國內不成熟的仿品，安全性毫無(wú)保障。Life公司的SYBR Green,SYBR Goad, SYBR Safe嚴格意義上來(lái)講，不能稱(chēng)作安全染料。Biotium公司的GelRed，Gelgreen是一款真正意義上的安全染料，染色效果也好，但價(jià)格奇高，做一塊50ml的瓊脂糖凝膠，染料成本接近8元！
2015年，李記生物經(jīng)長(cháng)期研發(fā)，開(kāi)發(fā)成功國產(chǎn)GelRed,GelGreen染料。這兩款產(chǎn)品全面優(yōu)于SYBR系列染料，在靈敏度、熒光強度、穩定性等方面甚至優(yōu)于原創(chuàng )廠(chǎng)家Biotium公司產(chǎn)品（見(jiàn)圖1.），而價(jià)格僅為原廠(chǎng)2/3。
 

 
　　圖1：I、Hela細胞與SYBR Green,李記GelRed及李記GelGreen在室溫下孵育一小時(shí)，用Olympus熒光顯微鏡觀(guān)察并拍照，與SYBR Green孵育的細胞顯示出綠色熒光，表明染料已透過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞并與核酸結合。李記GelRed，李記GelGreen未顯示熒光，說(shuō)明李記染料未能透過(guò)細胞膜進(jìn)入細胞。 II、SYBR Green,李記GelRed及李記GelGreen染料相同DNA濃度下染色效果。
 
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二、HRM專(zhuān)用熒光染料 —— LyGreen
        高分辨率熔解曲線(xiàn)(high-resolution melting，HRM)是一種基于單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線(xiàn)的基因分析新技術(shù)，具有*的敏感性，可以檢測出單個(gè)堿基的差異，并且成本低、通量高、速度快、結果準確、不受檢測位點(diǎn)的局限，實(shí)現了真正的閉管操作。在突變掃描、單核苷酸多態(tài)性分析、甲基化研究、基因分型、序列匹配等方面HRM分析技術(shù)發(fā)揮著(zhù)重要作用。
        HRM分析的一個(gè)必要條件是飽和染料，勝任這一任務(wù)的染料僅有：LC Green,SYTO 9, LyGreen等幾個(gè)產(chǎn)品。
        LyGreen™飽和核酸染料是一種新型的的雙鏈DNA結合飽和熒光染料，是新一代用于HRM分析的熒光染料，也可用于實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）。該染料結構上由兩個(gè)單體染料分子通過(guò)一個(gè)彈性臂連接成一個(gè)二聚體，在沒(méi)有dsDNA存在時(shí)，該結構呈無(wú)熒光環(huán)狀結構，一旦有dsDNA出現，則恢復隨機形態(tài)并與dsDNA結合發(fā)出強烈的綠色熒光。 與其他熒光染料如SYBR Green I 相比，LyGreen具有如下突出優(yōu)點(diǎn)： 1）高靈敏度：在推薦濃度下使用時(shí)可以獲得比SYBR Green I 更強的信號。 2）準確：飽和結合雙鏈DNA全部小溝位置，變形時(shí)染料不遷移，熒光信號準確反映雙鏈DNA變化情況；過(guò)量染料形成二聚體，而不游離，使得LyGreen對PCR的抑制遠小于SYBR Green I，因此，使用LyGreen進(jìn)行的qPCR實(shí)驗可以使用快速PCR步驟。 3）高穩定性：在正常的儲存、操作和PCR過(guò)程中不會(huì )被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲存在室溫或冰箱里，也可以反復凍融。 4）安全性好：細胞膜穿透性測試表明，LyGreen幾乎不能穿透細胞膜，安全性高。 5）兼容性：和SYBR Green I 光譜相似，使用不同品牌qPCR儀器時(shí)不許改變光譜元件設置，也無(wú)需改變操作步驟，qPCR完成后，無(wú)需加入其它核酸染料便能直接在凝膠成像系統下觀(guān)察分析。 6）重復性好（如圖2.）：特殊設計染料，相同反應體系下，熒光信號釋放僅與雙鏈濃度有關(guān)，線(xiàn)性。
 
圖2.： LyGreen染料用于綿羊FecB基因HRM分析. HRM分析設備為L(cháng)ightCycler@480熒光定量PCR儀(德國羅氏)
 
 
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三、PikoGreen——一種極為靈敏的雙鏈DNA定量熒光染料。
       對微量的雙鏈 DNA 進(jìn)行定量在各種生物學(xué)應用中都顯得非常重要,例如 cDNA 文庫的構建；用于亞克隆的 DNA 片段的純化；定量 DNA 擴增產(chǎn)物,在藥物中DNA 分子殘留的測定等 。
       Picogreen染料是一種dsDNA定量熒光染料，基本不受ssDNA和RNA的影響，并且可以耐受一定濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白等干擾。目前使用Picogreen染料定量檢測DNA已經(jīng)廣泛用于生物學(xué)檢測，并被2010年版《中華人民共和國藥典》選為藥物殘留DNA定量方法。但是價(jià)格貴，貨期長(cháng)，假貨魚(yú)目混珠等在市場(chǎng)上普遍存在。
         PikoGreen是李記生物自主研發(fā)的一款新型dsDNA定量熒光染料，其檢測靈敏度高，可檢測到pg級DNA；檢測范圍寬，可跨越４個(gè)數量級；特異性好。在低檢測限，穩定性等方面全面超越PicoGreen, 是PicoGreen的替代產(chǎn)品，價(jià)格僅為PicoGreen的1/2. PikoGreen具有如下突出優(yōu)點(diǎn)： 1）靈敏：數量級較UV吸光讀數更敏感，可節省樣品； 2）特異性強：只結合dsDNA，特異性強，不受樣品常規污染影響。傳統紫外吸光法容易受樣品中存在的單鏈DNA，蛋白，RNA等影響； 3）耐受性好：耐受較高濃度的鹽、尿素、乙醇、氯仿、去垢劑、蛋白或瓊脂糖，可以直接定量PCR擴增產(chǎn)物而無(wú)需從反應混合物中純化DNA。 4）線(xiàn)性范圍寬：PikoGreen dsDNA染料測定DNA濃度，在100pg/ml-100ng/ml范圍內呈良好線(xiàn)性；熒光計兼容。 5）容易使用：在樣品中加入染料，等待5-6分鐘染色，然后讀數即可，且適用于96和384孔板；與大多數基于熒光的酶標儀和可適用于各種DNA樣品分析，PCR的分析、芯片樣品、DNA損傷分析、酶活性分析、基因組DNA定量以及復雜混合物中dsDNA的檢測和病毒DNA定量等多種領(lǐng)域。 6）PikoGreen dsDNA檢測dsDNA的線(xiàn)性關(guān)系良好!（見(jiàn)圖3、圖4、圖5）
 
圖 3.PikoGreen Broad Range dsDNA （Ex/Em 350/460nm）檢測不同類(lèi)型dsDNA，表現出良好線(xiàn)性關(guān)系。
 
圖 4.分別使用PikoGreen Broad Range dsDNA 和Quant-iT檢測calf thymus DNA，顯示 PikoGreen dsDNA 測得的 DNA 樣本線(xiàn)性關(guān)系更好，且動(dòng)態(tài)測量范圍更廣
 
圖5. 用PikoGreen Broad Range dsDNA梯度標準calf thymus DNA溶液所做的線(xiàn)性回歸分析。
 
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四、李記生物研發(fā)部特別提醒：
　　在生物技術(shù)飛速發(fā)展的今天，從事分子生物學(xué)研究的科員人員幾乎每天都與核酸打交道，各種核酸染料也如食品中的味精*。不管我們對安全染料多么有信心，也不管您選擇何種EB替代產(chǎn)品，總之還是奉勸大家牢記----珍愛(ài)生命，請帶手套。一時(shí)半會(huì )兒看不出問(wèn)題，可年輕的我們，來(lái)日方長(cháng)呢！還有,各種染料染色后的廢棄試劑，請盡可能的規范處理，請做個(gè)負責任的實(shí)驗人。