AB11L234-G418（遺傳霉素）

AB11L234-G418（遺傳霉素），也稱(chēng)作Geneticin (遺傳霉素)、G418、G 418或者G-418，是一種結構類(lèi)似于慶大霉素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類(lèi)抗生素，來(lái)源于Micromonospora rhodorangea，常用于篩選表達neo基因的真核或原核多克隆或單克隆細胞。

G418不僅用于穩定細胞株的篩選，也用于穩定細胞株的維持。本產(chǎn)品的50mg/ml包裝經(jīng)過(guò)過(guò)濾除菌，可以直接用于細胞培養。

在細菌、酵母、原生動(dòng)物、蠕蟲(chóng)、高等植物和哺乳動(dòng)物中，遺傳霉素通過(guò)抑制蛋白合成而抑制或殺死細胞。其作用機制為遺傳霉素能夠與70S和80S核糖體結合，從而阻斷肽鏈延伸，干擾蛋白合成。其抗性基因(主要為neo基因)位于轉座子Tn601 (903)或Tn5(來(lái)源于細菌)，可以在真核細胞中表達。通過(guò)基因重組技術(shù)將這些抗性基因導入細胞，使細胞表達抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)，從而獲得對G418的耐藥性，用來(lái)篩選和維持培養攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。

哺乳動(dòng)物細胞中，當抗性基因neo被整合進(jìn)真核細胞基因組后 ,編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase, APH(3)II)。此酶通過(guò)共價(jià)修飾G418的氨基或羥基功能，抑制抗生素-核糖體間的相互作用，從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chǎn)生抗性而能在含有G418的選擇性培養基中生長(cháng)。進(jìn)行穩轉細胞株篩選實(shí)驗時(shí)，需要建立劑量反應曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve)確定殺死無(wú)抗性細胞的zui低有效濃度。

植物細胞中，通過(guò)轉染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶，這個(gè)酶使得多種抗生素喪失活性，包括 G418，卡那霉素和巴龍霉素。

G 418與新霉素同為氨基糖苷類(lèi)抗生素，都可被Neo基因產(chǎn)物失活，因此都可以用于篩選攜帶Neo抗性基因的細胞，新霉素篩選的細胞都可以用G418替代。

訂購信息

常溫運輸。4℃保存，有效期36個(gè)月。

技術(shù)參數

1.CAS：108321-42-2

2.分子式：C20H40N4O10·2H2SO4  

4.分子量：692.71

5.純度：~98%
6.結構式：

AB11L234-G418（遺傳霉素）使用方法

1.G418儲存液的配制(50mg/ml，活性濃度)
（1）活力單位的換算
　　根據此公式進(jìn)行換算：(1000/A0)×A1=A2，其中A0是G418的活力值(Potency)，因批次而異，具體見(jiàn)瓶子的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)際稱(chēng)重的粉末與體積比濃度。
　　比如若所用批次的G418 活力值為：750µg/mg，要配制50mg/ml的G418活性濃度，則實(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50mg/ml=66.33mg/ml。
　　如果配制10ml的G418儲存液(活性濃度，50mg/ml)，則需要稱(chēng)取663.3mg粉末。
（2）除菌和保存
　　根據上述換算得到的實(shí)際粉末稱(chēng)重量，加入10ml無(wú)菌去離子水使其*溶解。
　　先用5ml無(wú)菌去離子水預濕潤0.22μm針頭式過(guò)濾器，除盡水。之后使用此濾器過(guò)濾，除菌后分裝成單次使用的小量(如1ml)放到-20℃凍存，1年穩定。
【注】：不要對混濁的溶液進(jìn)行過(guò)濾，因為混濁的溶液意味著(zhù)藥物未*溶解，過(guò)濾過(guò)程中會(huì )造成藥物損失，降低活性；不建議使用液體培養基，NaCl，磷酸鹽溶液或者有機溶劑來(lái)制備儲存液；配制G418溶液時(shí)，一定要根據相應批次G418標注的活力值(potency)來(lái)進(jìn)行換算，從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
2.建議使用濃度
　　一般來(lái)說(shuō)，剛開(kāi)始篩選轉化子需要高濃度的G418，并用一個(gè)較低濃度的G418維持培養。生長(cháng)條件，細胞類(lèi)型和其它的環(huán)境因素都可能影響G418的用量，因此第一次使用的實(shí)驗體系建議通過(guò)劑量反應性曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve)，來(lái)確定最佳篩選濃度。
　　通常情況，哺乳動(dòng)物細胞篩選范圍200-2000μg/ml；植物細胞：10-100μg/ml；酵母細胞：500-1000μg/ml。

表1.部分哺乳動(dòng)物細胞的推薦工作濃度表。

3.遺傳霉素劑量反應曲線(xiàn)的建立
　　遺傳霉素的有效篩選濃度跟細胞類(lèi)型、生長(cháng)狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝及細胞所處細胞周期等因素相關(guān)。為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株，確定能夠殺死未轉染宿主細胞的遺傳霉素zui低濃度非常重要，對于初次使用的細胞，一般需要通過(guò)實(shí)驗來(lái)確定適合自身實(shí)驗體系的劑量反應曲線(xiàn)(dose-response curve or kill curve)，曲線(xiàn)建立時(shí)至少應設置6個(gè)遺傳霉素濃度。遺傳霉素處理分裂期的細胞時(shí)活性*，因此在添加遺傳霉素之前需要先將細胞培養一段時(shí)間。
（1）第一天：未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上，37℃，CO2培養過(guò)夜。
注：對于需要更高密度來(lái)檢測活力的細胞，可增加接種量。
（2）根據細胞類(lèi)型，設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細胞為例，可設定0、50、100、200、400、800、1000μg/ml。
（3）第二天：去除舊的培養基，換用新鮮配制的含有相應濃度遺傳霉素的培養基。每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。更換培養基后在細胞培養箱中繼續培養。
（4）接下來(lái)每3-4 d更換新的含藥物培養基。
（5）按照固定的周期(如每2 d)進(jìn)行活細胞計數來(lái)確定阻止未轉染細胞生長(cháng)的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10 d)內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。
4.穩定轉染細胞株的篩選
（1）細胞轉染48h后，將細胞置于含有適當濃度遺傳霉素的新鮮培養基中培養，此為處理組。
（2）【注】：當細胞處于分裂活躍期時(shí)，抗生素作用zui明顯。當細胞過(guò)于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會(huì )明顯下降，所以細胞的密度最好不超過(guò)25%。建議同時(shí)做一個(gè)正常細胞的對照組。轉染或感染48 h后，如果細胞過(guò)密也可以消化后重新接種細胞，培養過(guò)夜后即可進(jìn)行遺傳霉素篩選。每隔3-4 d更換含有遺傳霉素的培養液。

（3）篩選7 d后觀(guān)察并評估細胞克隆(集落)的形成情況。對照組正常細胞應該100%死亡，處理組中存活的細胞為表達neo基因的細胞。根據宿主細胞種類(lèi)和轉染/篩選效率不同，集落的形成可能需要一周或者更多的時(shí)間。
（4）克隆形成后，挑取并轉移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細胞培養板，繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7 d。
（5）之后更換正常培養基培養即可。

注意事項

1.本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.用于細胞實(shí)驗，溶解后，須用一次性針頭濾器過(guò)濾除菌。

3.本產(chǎn)品不可高壓滅菌。

4.G418不要和其它抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用，因為它們是G418的競爭性抑制劑。其它的抗生素也會(huì )產(chǎn)生交叉活性。

5.G418加入培養體系中，未轉染的細胞有可能不會(huì )被殺死，原因在于藥物濃度過(guò)低，或者細胞密度過(guò)高。另外，快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞，更容易被殺死。對照細胞(未轉染)可能在添加抗生素5-7 d后才能被殺死，轉染細胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14 d形成。

6.即使加入有效劑量的G418，細胞可能會(huì )繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2 d后才變得明顯。

7.本產(chǎn)品可能對人體有一定的毒害作用，請注意適當防護，以避免直接接觸人體或吸入體內。

8.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

9.抗生素不穩定，請在有效期內盡快使用。

10.以上數據均來(lái)自公開(kāi)文獻, 李記生物暫未本產(chǎn)品進(jìn)行獨立驗證, 僅供參考。

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