細胞凍存液分類(lèi)與選擇

　　細胞凍存是細胞生物學(xué)研究及藥物研發(fā)細胞實(shí)驗中需要經(jīng)常面對的常規操作。隨著(zhù)細胞越來(lái)越嬌，人工越來(lái)越貴，各種細胞凍存液應運而生，如何從名目繁多的細胞凍存液中選擇變成一個(gè)問(wèn)題。本文從細胞凍存液分類(lèi)，應用場(chǎng)景，使用效果等多方面加以闡釋?zhuān)Ｍ軐θ绾芜x擇細胞凍存液有所助益。

一、細胞凍存液的分類(lèi)

1. 從成分劃分

（1）滲透性和非滲透性

　　滲透性保護劑分子量小可滲透到細胞內，如甘油、DMSO、乙二醇等，其在細胞冷凍存*凝固之前，滲入細胞內，降低細胞內外溶液中的電解質(zhì)濃度，阻止細胞內水分外滲，避免細胞過(guò)分脫水皺縮，避免細胞內外環(huán)境冰晶的生成。
　　非滲透性保護劑不能滲透到細胞內，多為大分子物質(zhì)，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡聚糖、白蛋白及羥、yi、ji淀粉(HES)等。這些大分子優(yōu)先同溶液中的水分子結合，降低了細胞外自由水的含量，使冰點(diǎn)降低，減少冰晶形成；同時(shí)，由于分子量大，使溶液中電解質(zhì)濃度降低，減輕了溶質(zhì)損傷。

　　DMSO是一類(lèi)滲透性細胞凍存保護試劑的代表，這類(lèi)試劑包括：甘油、DMSO、乙烯醇和乙酰胺等。從上述幾種物質(zhì)滲透進(jìn)出細胞的速度及細胞凍存效果看，DMSO效果更好，所以常規的細胞凍存液大都含有DMSO。DMSO在細胞凍存中保護細胞的原理是快速降低細胞內外電解質(zhì)濃度、減少降溫通過(guò)冰點(diǎn)時(shí)冰晶產(chǎn)生進(jìn)而保護細胞免受傷害。傳統的細胞凍存液是使用培養基、血清和DMSO按照一定的比例混合，其中DMSO的含量是10%。

（２）是否含血清

　　細胞凍存液含血清是從細胞生長(cháng)環(huán)境角度考慮對細胞進(jìn)行保護，但含血清（屬動(dòng)物源成分）勢必需要考慮細胞污染、批間穩定性等因素，另外隨著(zhù)細胞治療研究逐漸成為熱點(diǎn)，研究及生產(chǎn)過(guò)程的可預知、可控制要求，胎牛血清的使用液受到限制。包括李記生物在內的多家公司陸續開(kāi)發(fā)成功不含血清的細胞凍存液，不含血清及動(dòng)物來(lái)源性蛋白，減少病毒、霉菌和支原體等的污染。含血清的細胞凍存液一般采用程序降溫（4℃→-20℃→-80℃→液氮），原因是血清中含有大量蛋白、細胞因子，血清含量較大的凍存細胞凍存液在溫度快速降低時(shí)，會(huì )造成有較多蛋白沉淀。

（３）是否含DMSO

　　作為滲透性細胞保護劑的代表，DMSO應用非常廣泛，DMSO可以快速滲透進(jìn)入細胞，是非程序性降溫的基礎。但是DMSO在低溫下能保護細胞，但在常溫下卻對細胞有害，研究結果表明，培養液中DMSO濃度為10 %時(shí)，細胞生長(cháng)抑制率近100 %；1%濃度時(shí)抑制率為35%，即使是0.04 %的濃度，DMSO對細胞的生長(cháng)也有不利的影響。正是因為如此，細胞復蘇后需要離心去除DMSO。在一些臨床研究中，如果在細胞凍存中用到了DMSO，則需要說(shuō)明其對細胞的毒副作用是否對細胞功能產(chǎn)生影響，也需要說(shuō)明DMSO殘留的問(wèn)題。DMSO替代物的開(kāi)發(fā)也是從滲透與非滲透兩個(gè)方向研究，目前來(lái)看，滲透性的小分子化合物更具前景。李記生物從2015年開(kāi)啟不含血清，不含DMSO的細胞凍存液產(chǎn)品的研發(fā)；第一代低DMSO得GMP級別凍存液已于2022年上市，詳情可關(guān)注李記生物微信公眾號文章-搜索“凍存液"。

2. 從操作過(guò)程劃分

　　是否需要程序降溫是細胞凍存中需要考慮的另一個(gè)因素。常規細胞凍存液采用培養基+血清+DMSO配置，一般需要采用程序降溫凍存細胞（先將冷凍管置于4℃冰箱10分鐘，然后移至-20℃冰箱30分鐘，再移至-80℃冰箱保存16-18個(gè)小時(shí)（或隔夜），最后才移至液氮罐中進(jìn)行長(cháng)期的儲存）。目前包括李記生物已經(jīng)有多款新型細胞凍存液上市，不需要程序降溫，一步深凍，無(wú)需照看，節約了實(shí)驗時(shí)間。

二、細胞凍存液選擇

　　細胞凍存液的選擇須遵循幾個(gè)原則：①細胞在凍存和溶解過(guò)程中的損傷減低到最小，細胞存活率高；②凍存細胞復溫后，其的細胞生物學(xué)特性無(wú)明顯影響；③細胞復溫后，低溫保護劑容易去除，成分清楚，對細胞、人體無(wú)毒副作用；④凍存保護劑可快速起效，減少操作步驟；⑤價(jià)格。

三、注意事項

1. 常規細胞凍存液配方為基礎培養基（含10%胎牛血清）與DMSO按9:1配制。DMSO溶于培養基時(shí)，DMSO加入培養基將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配制，避免燙傷細胞。注意，不能直接在細胞培養液中添加DMSO。

2. 選擇不含DMSO的細胞凍存液時(shí)，需確認替代成分的物質(zhì)基礎，如果替代成分較DMSO潛在危害更大，則得不償失。

3. 選用不含DMSO的細胞凍存液，需確認無(wú)細菌及細胞污染，要進(jìn)行支原體檢測。